Wajan pembekuan alginat dalam sel pemesanan Kristal: pembekuan sel batang Pluripotent manusia dengan alginat

Dalam tiga masalah pertama, kami membagikan studi D(+)-trehalose dihidrat dalam perlindungan kriobola sel presursor oligobrcyte (OPCs), sel induk turunan adipose (ADSCs), sel kuman testis tikus, dll. Kajian ini menemukan bahwa menambahkan jumlah D(+) yang cocok-trehalose dihydratic ke media reservasi KK atau menggunakan cryoprotectant (CPA) Mengandung D(+)-trhalose dihydride dan Gliserol dapat meningkatkan tingkat pemulihan sel setelah pemesanan kriopi jangka panjang.

Dalam masalah ini, kami mengembangkan pemahaman yang jelas tentang efek cryoprotective dari D(+)-trehalose dihidrasi dalam tiga garis sel batang pluripotent manusia yang berbeda melalui artikel yang diterbitkan diPenelitian sel indukPada 2018 oleh peneliti dari Milan, Italia.

Pemesanan sel batang plurifotent manusia dengan D(+)-Trehalose dihydratic

Perkenalan

Produk terapi sel, termasuk sel induk, memiliki potensi klinis yang tinggi. Pasar sel batang global melibatkan penyimpanan sel hulu dan aliran Tengah serta aplikasi klinis hilir. Menurut laporan transparansi Market Research (TMR), pasar sel induk global diharapkan mencapai US $270.5 miliar pada akhir 2025, dan tingkat pertumbuhan tahunan senyawa pasar sedang berada untuk mencapai 13.8% Dalam 8 tahun terakhir.

Untuk memastikan keberhasilan Aplikasi dari produk terapi sel, pemesanan sel dalam jangka panjang adalah kesulitan teknis yang harus ditanyakan karena KK Reservasi hanya tersedia untuk pelestarian jangka panjang dan fungsi biokimia sel.

Untuk menghindari kerusakan pada struktur seluler yang disebabkan oleh pembekuan intrseluler, cryoproteclans dikembangkan dan dipasarkan. Cryoprotecsant sel yang paling sering digunakan adalah dimethyl sulfoksida (DMSO) dalam kombinasi dengan serum bovine (FBS) atau pengganti serum apa pun.

Namun, FBS mengandung protein turunan hewan xenogenik yang dapat menyebabkan infeksi zoonotik dengan deterjen yang tidak diketahui. Selain itu, DMSO adalah sitoksin. Dilaporkan bahwa ketahanan DMSO pada tisu dan sel secara langsung berkaitan dengan waktu eksposur, suhu, dan konsentrasi. Tingkat kepadatan bervariasi sesuai dengan jenis sel, dan efek samping telah dilaporkan pada pasien kembali injeksi dengan sel yang mencairkan tanpa menghilangkan DMSO. Selain itu, DMSO dikenal untuk memengaruhi genom epitanduk mouse dengan mengatur tingkat transkrip tiga metiltransferase DNA (Dnmts) dan mengubah profil metilasi genom lebar, yang pada akhirnya menyebabkan berakhirnya sel batang mouse yang tidak terkendali. Untuk semua alasan ini, DMSO + FBS tidak cocok untuk penggunaan klinis. Ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan cryoprotectans yang efisien dan tidak beracun.

D(+)-trehalose dihydride adalah payung tidak mengurangi hidrolisis dalam berbagai organisme yang mampu bertahan hidup dehidrasi lengkap, seperti bakteri, Yeast, tardigrade, dan nematode. Membran tidak menghasilkan D(+)-trhalose dihydride, tapi efektif sebagai krioprotektor sel cupang, yang dapat mengurangi kerusakan sel yang disebabkan oleh kristal formasi es. Efek perlindungan dari D(+)-trehalose dihydride terkait dengan efek osmotik dan interaksi spesifik dari membran sel fosfolipid dan protein pelabelan, yang dapat mencegah kerusakan sel dan denaturasi karena desiccant dan oksidan stres.

Non-cytoxic D(+)-trhalose dihydrate telah efektif digunakan untuk reservasi berbagai jenis sel seperti spermatosit mouse, sel batang hematopoietik dewasa, sel batang mesenchymal, sel batang turunan adiposa (ADSCs), sel batang embrio manusia (hESCs) dan sel batang pluripotent diinduksi manusia (hiPSCs). D(+)-trhalose dihydride juga digunakan untuk pemesanan tali darah, sumsum tulang, dan islet manusia.

Hambatan utama mencegah penggunaan luas D(+)-trehalose dihidrat dalam pelestarian sel adalah sulit untuk D(+)-trhalose dihidrat untuk mengakses interior sel. Beberapa berarti telah diterapkan sebelumnya untuk mengatasi masalah, seperti shock osmotik, pengiriman liposom, perforasi panas, elektroporasi, microinjeksi, dan rekayasa genetika. Namun, metode di atas memerlukan operasi yang kompleks, memberikan kesabaran dan membuang waktu, dan dapat menyebabkan kerusakan sel secara signifikan.

Dalam studi ini, tiga jenis garis sel batang pluripotent adalah cryoproteclant yang disediakan dengan empat cryoprotectant yang berbeda yang disiapkan menggunakan D(+)-trhalose dihidrat sendiri atau dalam kombinasi dengan ethylene glycol atau gliserol, masing-masing. Lini sel kemudian dianggap untuk menyelidiki parameter kunci termasuk morfin sel, semangat post-thaw, tingkat ekspresi plurigen, stabilitas genomic, reticulator endoplasma (ER) homeostasis, dan respon kerusakan DNA, mengukur tutup cyroprotectiveKapabilitas empat cryoprotecsant pada sel batang pluripotent.

Komposisi Cryoprotectant yang berbeda

Semua cryoprotecsant baru disiapkan dan diencerkan dalam phosphate buffered saline (PBS). Sel yang digunakan dalam studi disediakan kembali menggunakan CS10. CS10 mengandung 10% DMSO adalah serum dan komponen hewan bebas komponen cryoprotectant, yang direkomendasikan untuk krioperlindungan sel batang pluripotent manusia (hPSCs).

Reservasi kriopi dan pencairan sel

Budaya sel dalam kondisi tertentu. HESCs-RC17 dissosiasi dengan EDTA 0.5 mM, treat hiPSCs-CTR2 #6 dan ltNES-AF22 dengan solusi pelepasan sel, dan menyimpan di cryoproteclants yang baru saja disiapkan (A, B, C, dan D). Resuspend 2.0 × 10 ^ 6 sel dalam 1.5 mL masing-masing cryoprotectant dan transfer ke botol kriogenik.

Botol kecil kriogenik yang keren dalam wadah pembeku sekitar-1 ℃/menit, dan transfer ke freezer di-80 ℃ setelah penyimpanan semalam. Setelah 24 jam, transfer botol itu kriogenik ke nitrogen cair untuk penyimpanan setidaknya satu minggu.

Hangatkan botol kriogenik dalam mandi air pada 37 ℃ hingga massa es menghilang, dan mengurangi suspensi sel dengan medium hangat. Kumpulkan sel 200g tisu dengan sentrifugal untuk 3 menit dan biji Ke wadah budaya berlapis cocok untuk setiap jenis sel pada ukuran inokuler yang ditunjukkan.

Hasil dan diskusi

Semangat sel ①

Ukur semangat sel dengan agen alamarBlue 48 h setelah pencairan

Pertama, untuk menentukan jumlah yang tepat dari D(+)-trhalose dihydride, etilen glikol, dan gliserol, konsentrasi yang berbeda dari solusi komponen tunggal digunakan untuk garis sel batang yang berbeda. Keandalan sel setelah pencairan dan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Hasilnya menunjukkan bahwa 0.5 M D(+)-trhalose dihydride, 10% etilen glikol dan 10% gliserol adalah jumlah yang sesuai, tetapi ada perbedaan besar antara jenis sel batang yang berbeda.

Setelah menentukan konsentrasi awal, empat cryoproteclant yang berbeda (lihat di atas) digunakan untuk reservasi kristal tiga garis sel stem: (Group A) hESCs-RC17, (Group B) hiPSCs-CTR2 #6, dan (Group C) ltNES-AF22. Semangat sel diukur setelah pencairan. Laju bertahan hidup sel juga dibandingkan dengan sel yang sama disediakan dalam CS10 di bawah kondisi yang sama.

Ketika sel disediakan kembali dengan D(+)-trehalose dihidrat saja (Grup A), tingkat pemulihan sel setelah pencairan, bervariasi dari 20% hingga 60% untuk jenis sel yang berbeda.

Ketika D(+)-trhalose berbasis dihidridrat dilengkapi dengan 10% etilen glikol atau 10% gliserol (kelompok C dan D), laju kelangsungan hidup sel hESCs-RC17 dan ltNES-AF22 mencapai tingkat yang sama seperti cryopreservasi di DMSO. Namun, tingkat bertahan hidup sel hiPSCs-CTR2 #6 cryopreservasi dalam gliserol lebih baik dibandingkan dengan etilen glikol.

Selain itu, membandingkan hasil dengan kontrol cryoprotecsant yang mengandung etilen glikol atau gliserol saja, telah dikonfirmasi bahwa peningkatan tingkat bertahan hidup adalah karena efek gabungan dari etilen glikol/gliserol + D(+)-trehalose dihydride.

Hasil ini menyarankan D(+)-trehalose dihydratic dapat digunakan untuk reservasi sel batang pluripotent manusia dan diharapkan mengganti DMSO, dan menambahkan 10% etilen glikol atau 10% Gliserol dapat secara signifikan meningkatkan tingkat bertahan hidup dari krioprotektor trehalose. Maksud "kelangsungan hidup sel" meningkat dibandingkan dengan CS10. Cryoprotectasi etilen glikol/gliserol dan D(+)

② Cell morphology

Kekhawatiran lainnya denganReservasi cryoopreservasi sel induk adalah modifikasi kesalahan dan pluripotensial. Selama pembekuan dan jubah, kristal es dan gelembung dapat membentuk di dalam dan di luar sel, mengganggu spindel mikromida untuk menginduksi kromosa normal dan menghasilkan perubahan dalam karakteristik pertumbuhan sel dan morfin. Oleh karena itu, kemungkinan kerusakan pada kromometer dan potensi pluripoten dari sel batang dapat dengan mudah dinilai dengan pengamatan morfin sel setelah mencairkan.

Gambar atas menunjukkan morfin sel hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6 dan ltNES-AF22 48 h setelah mencairkan. Gambar kontras fase menunjukkan bahwa D komposit ( )-trehalose dihyclans tidak menyebabkan perubahan orfin yang signifikan pada setiap garis sel, dan morfin sel identik pada sel yang diawetkan dalam CS10.

③ Tingkat ekspresi penanda

Untuk mengkonfirmasi bahwa hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6, dan ltNES-AF22 setelah mencairkan mempertahankan sifat kunci dan karakteristik sel batang pluripotent, tingkat ekspresi dari beberapa penanda dianalisis oleh RT-PCR kuantitatif 48 h setelah nampan.

Penanda sel Nanog, Oct4 dan Sox2 terdeteksi untuk hESCs-RC17 dan hiPSCs-CTR2 #6, dan dibandingkan dengan kelompok kontrol.

Nesin dan Sox2 terdeteksi untuk ltNES-AF22 dan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Hasil menunjukkan bahwa potensi bersinar sel stem tidak terpengaruh.

④ Stabilitas kromosa

Untuk menilai efek D( ) Gambar di bawah ini menunjukkan hasil ltNES-AF22 sebelum dan setelah pemesanan kristal.

Secara keseluruhan, karyotype tetap stabil, tetapi salinan nomor variasi (CNVs) terdeteksi (personome 2, 8, 19, dan 22). Beberapa CNV mungkin hadir dalam sel utama dan lainnya mungkin muncul secara acak selama manipulasi sel bukan creoreservasi, tidak ada abrasi klonal aneuploidy atau kromoscan struktural muncul sebelum (angka C) dan setelah (Gambar D) cryopreservasi.

Adopsi ER penilaian tingkat protein tanpa stres/Terbuka

Studi ini juga berfokus pada apakah cryopreservasi dalam CS10 atau D( )-trehalose dihydrate terkena kemampuan pluripotent cells' untuk menanggapi stres endoplasmic (ER) dan mengaktifkan respon protein terbuka (UPR). Untuk mempertahankan homeostasis dalam kondisi fisiologis atau ologis yang berbeda, ER mengintegrasikan berbagai sinyal molekul dan seluler. Baik untuk stres maupun molekul UPR mediate dan mekanisme biokimia yang memengaruhi Duk sel, distilasi, dan apoptosis.

Secara keseluruhan, D( )-trhalose dihydride memamerkan tingkat stres/UPR sedang dibandingkan dengan CS10. Satu-satunya garis sel yang lebih sensitif adalah hiPSCs-CTR2 #6, yang menunjukkan BIP yang lebih tinggi dan memotong tingkat ekspresi gen dalam kelompok B dan C, menunjukkan bahwa pemesanan kristal dengan D( )-trehalose dihydrate tidak secara signifikan mengubah ER homeostasis dari sel batang multipotent dibandingkan dengan CS10.

Janji

Reservasi kristal sel induk jangka panjang memiliki potensi aplikasi yang bagus di banyak bidang seperti transplantasi sel dan terapi sel. Beberapa studi telah mengoptimalkan sarana untuk reservasi kristal sel induk pluripotent manusia, dan reservasi kristal jangka panjang dengan D( )-trhalose dihidrat mungkin merupakan metode yang ideal.

Sel batang pluripotent manusia yang diawetkan dalam D( )-trehalose dihidrat cryoprotectane mempertahankan fenodijenis seluler dan properti fungsional, menunjukkan potensi aplikasi D( )-trhalose dihidrat dalam terapi klinis. Meskipun studi lebih lanjut dibutuhkan untuk mengevaluasi keamanan biokeselamatan sel yang disediakan dengan komposit D( )-trhalose dihidrolektor, kombinasi D( )-trhalose dihidrat dengan etilen glikol atau gliserol, sebagai cyroprotectant biosafety tanpa cycotcarbonity atau protein turunan hewan, menunjukkan janji yang bagus untuk aplikasi klinis.